FLIM
Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) ist ein Fluoreszenz-basiertes bildgebendes Verfahren, das im Gegensatz zur klassischen Fluoreszenzmikroskopie nicht auf einer Messung der Fluoreszenzintensität, sondern zusätzlich die Lebensdauer der angeregten Zustände der Fluorophore bestimmt.
FLIM ermöglicht die Differenzierung von Fluorophoren, die durch starke Überschneidungen in ihren Anregungs- und Emissionswellenlängen charakterisiert sind, sich jedoch in ihren Fluoreszenzlebensdauern deutlich voneinander unterscheiden. Viele Fluorophore ändern zudem abhängig von den Umgebungsbedingungen sehr spezifisch ihre Fluoreszenzlebensdauer. So lassen sich beispielsweise pH-Wert oder Chloridkonzentration mittels FLIM quantitativ analysieren. Auch Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Sensoren zeigen unterschiedliche Lebensdauern bei Aktivitätsänderungen und können somit zusätzlich analysiert werden.
Tau-STED
Die “Stimulated Emission Depletion (STED) Mikroskopie” ist eine hochauflösende Mikroskopietechnik, die die Auflösungsgrenzen der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie unterschreitet. Hierbei wird neben einem konfokalen Anregungslaser ein Abklinglaser eingesetzt, der Fluoreszenz rund um den Fokuspunkt unterdrückt. Die Auflösungsgrenze von 200 nm bei konventionellen Lichtmikroskopieverfahren wird dabei auf bis zu 40 nm verbessert. Die STED-Mikroskopie eignet sich sowohl für fixierte als auch lebende Präparate. Daten können in Echtzeit akquiriert und analysiert werden. Für das Verfahren sind eine Vielzahl von Farbstoffen geeignet, jedoch können speziell optimierte Farbstoffe durch ihre hohe Fotostabilität für bestmögliche Ergebnisse herangezogen werden.
Bei der von Leica entwickelten tau-STED Technologie, werden sowohl die optischen Eigenschaften eines Fluorophors (Fluoreszenzintensität mittels STED), als auch dessen photophysikalische Eigenschaften (FLIM) gemessen, um ein hochauflösendes Bild mit geringeren Laserleistungen und besserem Signal-Rausch Verhältnis zu erzielen.
Equipment
Die Core Facility verfügt über ein inverses Leica SP8 Tau-STED3X
Dank eines Weißlichtlasers (WLL) können wir sehr flexibel unterschiedliche Wellenlängen von 470 bis 670 nm anregen. Wir haben an dem System zudem einen Argon Laser (458 nm, 476 nm, 488 nm, 496 nm, 514 nm) und einen UV-Laser (405 nm DMOD). FLIM Experimente können mit Wellenlängen von 470 bis 670 nm durchgeführt werden.
Für STED und tauSTED Höchstauflösung stehen zwei Abklinglaser zur Verfügung: 592 nm und 775 nm. TauSTED ist nur bei Anregungen zwischen 470 bis 670 nm möglich. Das Mikroskop wird in einem transparenten Gehäuse auf 22.5°C temperiert. Lebende Proben können beheizt (37°C) und mit 5% CO2 begast werden. Zudem können S1 Experimente durchgeführt werden.
